大肠杆菌蛋白表达系统是目前应用最广泛,也是最经济实惠的蛋白表达系统大肠杆菌具有遗传背景清楚、细胞增殖快、表达量高、稳转性好和抗污染能力强等特点,适用于多种属蛋白的表达,尤其对小分子量可溶性蛋白或者原核膜蛋白的生产具有极大的优势。沃臻生物拥有丰富的大肠杆菌可溶性蛋白和膜蛋白表达/纯化及蛋白复性经验,拥有多种大肠杆菌细胞株和表达载体,可为客户提供优质的原核蛋白表达服务。
1.T7大肠杆菌表达
T7大肠杆菌表达是用T7启动子和T7噬箘体转录体系的元件构建的表达系统。T7 RNA聚合酶是高活性RNA聚合酶,mRNA的合成速度是大肠杆菌中RNA聚合酶的五倍,并且某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶转录的序列也可以被转录,因此T7RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的存在的情况下,大肠杆菌本身的转录系统竞争不过T7噬箘体转录体系,最终受T7噬箘体启动子控制蛋白转录。
2.Lac和Tac大肠杆菌表达系统
它是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的大肠杆菌表达系统,具有多顺反子结构,结构排列为:启动子(lacP)-操纵基因(lacO)–结构基因(lacZ-lacY-lacA)
原理:在无诱导物的情况下,负调节因子lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白与启动子下游的操纵基因紧密结合,阻止转录的起始。加入诱导剂(譬如IPTG)后,诱导剂与lacI基因产物结合,使操纵基因解离出来,lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。
3.PL和PR大肠杆菌表达系统
以λ噬箘体早期转录启动子PL、PR为核心构建的系统称为PL和PR大肠杆菌表达系统。PL和PR启动子在高温下启动蛋白表达,不需要加入化学诱导剂,且成本低廉,因此起初几个在大肠杆菌系统中制备的药用重组蛋白质都采用这种表达系统。但在热刺激过程中,大肠杆菌中的一些蛋白水解酶会被激活,降解所表达的外源蛋白;其次是在大规模发酵培养菌体时,通过热平衡交换方式提高温度,需要较长的时间,这会降低诱导效果,从而对重组蛋白的表达量有影响。
T7大肠杆菌表达系统 | 优点 | 缺点 |
T7表达系统 | 目的基因的表达水平高 | 较高的本底表达 |
Lac表达系统 | 易于调控和操作 | 对表达和制备用于医疗的重组蛋白不适合 |
Tac表达系统 | 易于调控,转录水平高于lac | 对表达和制备用于医疗的重组蛋白不适合 |
PL和PR表达系统 | 不需要加入化学诱导剂,成本又低廉,转录能力强 | 可能降解所表达的重组蛋白 |
沃臻有各种商业化菌株:如TOP10、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)、BL21(DE3)CondonPlus、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta-gamiB(DE3)pLysS等适用于任何以T7启动子为基础的表达系统和M15(pREP4)、SG13009(pREP4)等适用于任何以T5启动子为基础的表达系统。我们也提供低内毒素的大肠杆菌表达株,降低内毒素对于蛋白品质的干扰。
基于上述菌株,我们为客户提供下列服务:
· 可进行不同温度的诱导表达(16℃-37℃)
· 可选择不同的培养基(LB、TB、2xYT、M9等);
· 不同的诱导表达方式(IPTG诱导、阿拉伯糖诱导、自诱导等);
· 可选择共表达chaperone提高可溶表达;
· 基于96孔板的高通量表达测试;
· 指定融合标签和修饰的蛋白表达;
1-2周 | 1-2周 | 1周 | 2-3周 | 2-3周 |
基因合成及密码子优化(可选) | 载体构建 | 表达鉴定和可溶性分析 | 放大表达和1-2步纯化 | 大量表达及纯化(可选) |
客户提供目的蛋白的序列信息或质粒 | · 克隆至表达载体 · 质粒测序 · 大量质粒制备 交付内容 · 测序报告(若客户要求) |
· 10mL培养 · 3个表达条件尝试 · 蛋白表达评估(SDS-PAGE) 交付内容 · 表达评估报告 |
· 蛋白纯化(可溶表达) · 蛋白变性复性纯化(包涵体) · QC分析(SDS-PAGE、UV等) 交付内容 · 0.5-1mg纯化蛋白样品(如蛋白表达可行) · 质量检验报告(COA) |
· 100mg或更多蛋白 · QC检测 交付内容 · 纯化蛋白 · 质量检验报告(COA) |
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